Biologia Molekularna Podstawy

Transkrypt

1 Biologia Molekularna Podstawy Budowa DNA Budowa DNA Zasady: Purynowe: adenina i guanina Pirymidynowe: cytozyna i tymina 2 -deoksyryboza Grupy fosforanowe Budowa RNA Budowa RNA Zasady: purynowe: adenina i guanina pirymidynowe: cytozyna i uracyl Zasada + cukier = nukleozyd Deoksyryboza Grupa fosforanowa ryboza Grupy fosforanowe Zasada + cukier + fosforan = nukleotyd DNA Ryboza RNA 1

2 Replikacja DNA Wytwarzanie kopii cząsteczek DNA znajdujących się w komórce. Zachodzi przed podziałem komórki. Z kaŝdej cząsteczki DNA powstają dwie identyczne cząsteczki DNA, będące dokładnymi kopiami cząsteczki macierzystej. Transkrypcja Proces podczas którego sekwencja nukleotydów w DNA genu jest kopiowana w powstającym łańcuchu RNA. Transkrypcję przeprowadzają polimerazy RNA. Enzymy te łączą pojedyncze nukleotydy (rybonukleotydy) w nić RNA Ich kolejność, ustanowiona dzięki łączeniu się komplementarnych zasad, odpowiada sekwencji deoksyrybonukleotydów w nici DNA, słuŝącej za matrycę. Translacja Proces, w którym sekwencja kodonów mrna jest tłumaczona na sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym Aminokwas łańcucha polipeptydowego jest dostarczany do miejsca translacyjnego rybosomu przez trna, którego antykodon pasuje do kodonu mrna. 2

3 NajwaŜniejsze terminy biologii molekularnej Transkrypcja Translacja Genom Gen Primery Enzymy restrykcyjne Hybrydyzacja Elektroforeza Wektory Sonda Mutacje Genom Gen Całość kwasów nukleinowych organizmu, które kodują enzymy, białka i inne komponenty strukturalne Dla większości bakterii pojedynczy, kolisty DNA Część genomu, która koduje specyficzny produkt, taki jak białko, enzym lub inną makrocząsteczkę Primery Enzymy restrykcyjne Krótkie odcinki nukleotydowe, które łączą się z sekwencją zdenaturowanego DNA SłuŜą jako inicjatory kopiowania poŝądanej sekwencji; są wydłuŝane przez polimerazę DNA Czasem zaprojektowane z wysoką specyficznością do konkretnego genu Enzymy produkowane naturalnie przez wiele gatunków bakterii jako mechanizm obronny Enzymy tną DNA w specyficznych miejscach połączeń A, G, C i T naleŝą do grupy endonukleaz EcoR1 jest pierwszym enzymem wyizolowanym z Escherichia coli 3

4 Hybrydyzacja Elektroforeza Hybrydyzacją nazywamy łączenie się komplementarnych regionów róŝnych nici kwasu nukeinowego. Technika badawcza polegająca na umieszczeniu cząsteczek kwasów nukleinowych np. w Ŝelu agarozowym znajdującym się w polu elektrycznym. Ujemnie naładowane cząsteczki DNA przemieszczają się w kierunku dodatniej elektrody, a szybkość ich ruchu zaleŝy od długości fragmentów badanych kwasów nukleinowych. Po odpowiednim zabarwieniu Ŝelu moŝna ocenić, jaka jest długość kawałków kwasów nukleinowych obecnych w roztworze poddawanym elektroforezie. Wektory Sonda Są to fragmenty DNA, które mają zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek i które zapewniają powielanie wprowadzonego fragmentu DNA, a takŝe ekspresję zawartych w nim genów Jeśli wprowadzimy do dowolnego organizmu, np. bakterii, fragment obcego DNA, to wkrótce zostanie on zdegradowany do pojedynczych nukleotydów. Aby temu zapobiec, fragmenty DNA wprowadzamy do komórek za pośrednictwem WEKTORÓW Wyznakowany fragment kwasu nukleinowego. Stosując sondy komplementarne do poszukiwanego fragmentu DNA moŝna go zidentyfikować stosując technikę hybrydyzacji. Sondy moŝna znakować radioaktywnie lub enzymami. 4

5 Mutacje Techniki biologii molekularnej Zmiana sekwencji kwasu nukleinowego która moŝe spowodować zmianę produktu genu lub jego ekspresji Insercja A, T, G or C Delecja A, T, G or C Substytucja zasad (mutacje punktowe) Inwersja PCR Klonowanie Blotting Technika southern Technika northern Sekwencjonowanie kwasów nukleinowych PCR PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy Metoda odkryta przez K. Mullis jako sposób kopiowania DNA in vitro PCR umoŝliwia syntezę milionów, a nawet miliardów kopii kaŝdej sekwencji genomowego DNA w czasie krótszym niŝ kilka godzin. UmoŜliwia badania przesiewowe DNA poszczególnych osobników na występowanie lub nieobecność częstych mutacji w znanych genach. Metodę PCR wykorzystuje się obecnie powszechnie do wykrywania infekcji wirusowych, równieŝ obecności wirusa HIV- 1 we krwi pacjentów chorych na AIDS (lub podejrzewanych o chorobę); Do badania samoczynnie powstających nowotworów ludzkich, aby określić ewentualne zmiany w sekwencji genów kontrolujących wzrost i podział komórek, Przed przeszczepami, do określania typu genów, od których zaleŝy układ zgodności tkankowej. PCR okazała się równieŝ potęŝnym narzędziem medycyny sądowej, dzięki temu, Ŝe próbka niezbędna do wykonania takich badań moŝe być znacznie mniejsza niŝ wymagają tego analizy bezpośrednie. PCR Składniki: 1. 2 odcinki primerowe 2. Trifosforany czterech deoksyrybonukleotydów 3. Polimeraza DNA odporna na temperaturę (Taq Thermus aquaticus- termostabilna polimeraza z termofilnych bakterii) PCR Etapy: 1. Denaturacja (rozdzielenie nici DNA)- ogrzanie do temp. 95ºC przez 15 sekund 2. Hybrydyzacja odcinków starterowych ANNEALING- szybkie ochłodzenie roztworu do 54 ºC umoŝliwia hybrydyzację primerów z nićmi DNA 3. Elongacja synteza DNA roztwór ogrzewa się do 72 ºC jest to temp. optymalna dla polimerazy DNA. 5

6 Klonowanie Klonowanie etapy Klonowanie DNA ułatwia izolację fragmentów genomu organizmów i manipulację tymi fragmentami dzięki niezaleŝnemu namnaŝaniu ich jako części autonomicznych wektorów 1. Fragmentowanie oczyszczonego DNA, z którego zamierzamy wyodrębnić gen (enzymy restrykcyjne, ultradźwięki) 2. Ligacja łączenie fragmentów genomowego DNA z cząsteczkami wektorowymi (rekombinowanie in vitro) Enzym: ligaza DNA 3. Klonowanie DNA - wprowadzenie zrekombinowanej cząsteczki do komórki, w której będzie on ulegał powielaniu. Zbiór klonów (organizmów identycznych genetycznie) nazywamy bibliotekami. 6

7 Blotting DNA SłuŜy do charakteryzowania sklonowanych DNA. UmoŜliwia równieŝ odnajdywanie wśród wielu, wielu innych, tego fragmentu DNA, w którym występuje poszukiwany gen. Jest równieŝ podstawową techniką diagnozowania wielu chorób genetycznych i wirusowych Stosuje się ją takŝe w medycynie sądowej do identyfikacji zarówno ofiar, jak i sprawców przestępstwa. Blotting DNA Mieszanina fragmentów uzyskana po potraktowaniu całkowitego komórkowego DNA enzymem restrykcyjnym moŝe być elektroforetycznie rozdzielona. Jeśli genom jest bardzo duŝy, tak jak genom ludzki (sześć miliardów par zasad), powstają miliony fragmentów o róŝnych wielkościach. Po wybarwieniu Ŝelu barwnikiem odróŝnienie poszczególnych fragmentów DNA jest niemoŝliwe wszystkie one razem bowiem tworzą jedną smugę DNA. Dzieje się tak dlatego, Ŝe Ŝaden z fragmentów (spośród milionów, które powstają) nie występuje w wystarczająco duŝej ilości, by stał się widoczny jako oddzielny prąŝek. Lecz jeśli taki Ŝel zostanie przeniesiony na arkusz nitrocelulozowy i zwiąŝe się z radioaktywną sondą DNA lub RNA, odpowiadający jej komplementarny fragment genomowego DNA ujawni się jako radioaktywny pojedynczy prąŝek w miejscu właściwym dla swojej wielkości. Wystarczy kilka milionowych części grama całkowitego genomowego DNA. Blotting DNA Blotting DNA 1. Ekstrakcja DNA z próbek np. krwi 2. Cięcie DNA na fragmenty przy pomocy enzymów restrykcyjnych 3. Fragmenty DNA są poddane elektroforezie na Ŝelu agarozowym 4. śel zostaje umieszczony w aparacie do blottingu, złoŝonym z: gąbki nasączonej buforem, Ŝelu, membrany nylonowej, serwetek papierowych, obciąŝenia 5. Podczas gdy bufor jest absorbowany przez papier, DNA zostaje przeniesione na membranę; w czasie tego etapu zachodzi denaturacja DNA na pojedyncze nici 6. Membrana zostaje poddana inkubacji w obecności pojedynczych nici DNA znakowanych radioizotopem, które łączą się do komplementarnych fragmentów na membranie 7. Membrana zostaje przemyta i pokryta kliszą, która po wywołaniu pokazuje lokalizację poszukiwanych fragmentów DNA DNA 7

8 Northern blotting RNA isolation AAAAAA Probe labeling dctp dttp dgtp datp Sekwencjonowanie DNA Gel electophoresis Blotting Hybridization pbs-semaiii Autoradiography Technika umoŝliwiająca poznanie sekwencji nukleotydów fragmentu DNA Polega na wytworzeniu zbioru cząsteczek róŝnej długości, z jednym typowym (znakowanym) końcem. Cząsteczki te są następnie rozdzielane elektroforetycznie w Ŝelu poliakrylamidowym, co pozwala odczytać sekwencję badanego DNA. 8