Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Transkrypt

1 Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, Warszawa tel ,

2 IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ. REAKCJA PCR. ELEKTROFOREZAW ŻELU AGAROZOWYM Uwagi wstępne: Praca z kwasami nukleinowymi wymaga zachowania szczególnej czystości, ponieważ kwasy nukleinowe łatwo ulegają degradacji. Miejsce do izolacji kwasów nukleinowych przemywamy 70% etanolem Wszystkie czynności wykonujemy w czystych rękawiczkach, które przemywamy 70% etanolem 1. Izolacja DNA z hodowli komórek 1.1.Przygotowanie materiału Komórki w ilości 1x10 6 należy odwirować i dokładnie zawiesić w 100µl buforu Tris 2.1. Protokół izolacji DNA Dodać 200µl uniwersalnego buforu lizującego LT Dodać 20µl roztworu Proteinazy K Całość wymieszać i inkubować w temp. 37 o C Przenieść próbkę do 75 o C i inkubować 5 min. Próbkę intensywnie worteksować 20 s Wirować 3 min przy 10-15tyś. RPM Pobrać supernatant i nanieść na minikolumnę do oczyszczania genomowego DNA Wirować 1 min. przy tyś.rpm Wyjąć minikolumnę wraz z probówką i dodać do kolumny 500µl roztworu płuczącego A1 Wirować 1 min. Przy tyś. RPM Przenieść minikolumnę do nowej probówki 2 ml i dodać do kolumny 400µl roztworu płuczącego A1 Wirować 2 min. Przy tyś. RPM Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce 1.5 ml i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać 200µl buforu Tris uprzednio ogrzanego do temp.75 o C 2

3 Uwaga: Jeśli spodziewamy się małej ilości DNA to możemy zmniejszyć ilość buforu elucyjnego do 100µl i w ten sposób zwiększyć stężenie DNA Inkubować próbkę przez 5 min. w temp. Pokojowej Wirować 1 min. przy tyś.rpm Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać w lodówce do czasu dalszych analiz Określenie stężenia oraz czystości DNA metodą spektrofotometryczną Kwasy nukleinowe selektywnie pochłaniają światło ultrafioletowe (UV) wykazując maksimum absorbancji przy długości fali 260 nm. Zjawisko to znajduje zastosowanie w oznaczaniu kwasów nukleinowych, np. w preparatach kwasów nukleinowych po izolacji. Ekstrakty kwasów nukleinowych mogą być zanieczyszczone np. białkami lub odczynnikami używanymi do izolacji. W celu określenia czystości przygotowanego preparatu mierzy się absorbancję również przy dł.fali 280 nm, stanowiącą maksimum absorbancji dla białek. Preparat uznaje się za czysty wówczas, kiedy stosunek wartości absorbancji A260/A280 mieści się w zakresie 1,9-2,1 Wykonanie przygotować 20-krotne rozcieńczenie prób DNA ( objętość próby do pomiaru 60 µl dobrać odpowiednie ustawienia aparatu ( objętość próby, rozcieńczenie materiału, rodzaj kwasu nukleinowego, długość fali) i skalibrować go używając do tego celu kuwety wypełnionej wodą ( A260=0) wypełnić kuwetę 60µl rozcieńczonej próby DNA i włożyć ją do spektrofotometru tak, by wiązka promieni przechodziła przez gładkie ścianki kuwety odczytać stężenie próby i przeanalizować wartość absorbancji przy długości fali 260 oraz 280nm 2.Wykonanie reakcji PCR 1.2.Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej Należy wykonać tzw. mix reakcyjny, do którego następnie należy dodać 1µl matrycy o stężeniu ng/µl 3

4 Skład mieszaniny reakcyjnej na jedną próbkę Bufor 10x 2µl dntp 1µl starter F 1µl starter R 1µl polimeraza 1µl matryca 1µl H2O uzupełnić do 20µl 2.2. Po przygotowaniu mieszaniny reakcyjnej i po dodaniu do niej matrycy w odpowiedniej ilości i o odpowiednim stężeniu należy wykonać reakcję PCR. PCR wykonujemy w termocyklerze, który umożliwia płynną zmianę temperatury Etapy reakcji PCR 1. Denaturacja.- pierwszym etapem jest rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA. W wysokiej temperaturze (zwykle około 95 C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95 na 15 sekund. 2. Annealing hybrydyzacja odcinków starterowych. Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składających się z przygotowanych starterów - cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen mający ulec namnożeniu - z matrycową cząsteczką DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy C), przyłączają się one do matrycy.. 3. Elongacja Na tym etapie zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund Po zakończonej reakcji nanieść próbkę w ilości 15µl na żel wcześniej przygotowany (wykonanie elektroforezy) 3. Elektroforeza agarozowa produktów reakcji PCR Produkt reakcji identyfikujemy rozdzielając uzyskany materiał w żelu agarozowym metodą elektroforezy. Równocześnie z badanym genem rozdzielamy w żelu standardy masowe- fragmenty DNA o znanych masach cząsteczkowych wyrażonych w ilości par 4

5 zasad. Na podstawie położenia badanego genu w stosunku do standardów masowych określamy jego wielkość. Wykonanie Przygotowanie 1,8% żelu agarozowego Do kolby stożkowej o poj.250 ml dodać odpowiednią ilość agarozy oraz 150 ml buforu TAE (40mM Tris-kwas octowy, ph 8.3, 1mM EDTA). Dokładnie rozpuszczać agarozę ogrzewając w mikrofalówce przez 3-5 min. Energicznie zamieszać zawartość kolby. Jeśli agaroza nie uległa rozpuszczeniu kolbę umieścić ponownie na kilka minut w mikrofalówce. Złożyć podstawę na żel z płytkami zamykającymi oraz grzebieniem do formowania studzienek. Do roztworu agarozy schłodzonego pod wodą bierzącą do temp st.c dodać 10µl bromku etydyny (uwaga: bromek etydyny ma działanie karcynogenne). Dokładnie wymieszać a następnie wylać żel na podstawę i odczekać do zastygnięcia min. Wyjąć płytki zamykające podstawę z żelem oraz grzebień. Wlać do aparatu ok. 300 ml buforu TAE Przygotowanie próbek Próbki po wyjęciu z termocylkera należy wymieszać, krótko zwirować a następnie nakładać w ilości ok.15µl do studzienek w żelu agarozowym. Rozdział elektroforetyczny Rozdział prowadzić przez min przy napięciu 100V. Wynik rozdziału elektroforetycznego analizować w transiluminatorze w świetle UV 5